Deze pagina werd het laatst bijgewerkt op: 28 mei 2004
Kweekmethoden - vast of vloeibaar
Om micro-organismen te kunnen bestuderen is het noodzakelijk dat je ze kunt kweken in een laboratorium. Hierbij kan onderscheid gemaakt worden tussen kweken in een vloeistof of op een vaste ondergrond. In beide gevallen wordt gebruik gemaakt van medium, al dan niet gestold, dat alle, voor de groei essentiële, voedingsstoffen bevat. Net als hogere organismen hebben micro-organismen natuurlijk energie nodig om te overleven en te groeien. Daarom wordt er een substraat, vaak bepaalde suikers, toegevoegd aan het medium. Verder worden er vitaminen door het medium gemengd. Elke bacterie heeft zo z'n specifieke voorkeuren wat de voeding en de omgevingscondities betreft. Zo kan gelet worden op de temperatuur, de pH en de zoutconcentratie. 
Foto's van kolonies van een duplococ(boven) en een schimmel (onder).

Maar er bestaan ook bacteriën die absoluut niet tegen zuurstof kunnen; voor deze organismen moet het medium anaëroob (zuurstofloos) gemaakt worden en moet er een flesje gemaakt worden dat goed afgesloten kan worden van de buitenlucht. Lucht bevat immers al 21volume-% aan zuurstof. Als micro-organismen het naar de zin hebben en alle omstandigheden ideaal zijn, gaan ze zich vermeerderen d.m.v. celdeling. Als met vloeibaar medium gewerkt wordt kan groei geconstateerd worden doordat de vloeistof troebel wordt of doordat je een soort neerslag ziet. Op vast medium (platen) worden kolonies gevormd. Dat zijn kleine “bergjes” van bacteriën (vaak wel duizenden op één hoop) die je gewoon met het oog kunt zien. Kolonies kunnen spectaculaire kleuren hebben, afhankelijk van de soort, het medium waarop ze groeien en of er bepaalde kleurreacties zijn uitgevoerd. In de plaatjes hierboven zijn enkele voorbeelden te zien. 

Microscopie
Fasecontrast microscopie
Microscopie is één van de oudste en snelste methodes om informatie te verkrijgen over de  verschillende micro-organismen in een monster. Voor achtergrondinformatie, historie en hedendaagse informatie over microscopie, kijk eens op deze site. Fasecontrast microscopie is een wat gespecialiseerde vorm van lichtmicroscopie, waarbij het contrasterend vermogen vergroot is, zodat contouren beter te zien zijn. Bij een vergroting van 100 keer en een druppel olie op het preparaatglas zijn de meeste bacteriën goed te zien. Alhoewel de morfologie van een micro-organisme een handig criterium is om te determineren, levert het nooit doorslaggevend bewijs. Er moet rekening gehouden worden met de fase van groei, het gebruikte substraat en allerlei andere factoren waarvan de morfologie van een bacterie afhankelijk is. 
 

Kleurreacties

Een aantal bacteriën hebben echter een unieke structuur die duidelijk herkenbaar is in microscopische beelden. Dit geldt bijvoorbeeld voor Crenothrix sp., te zien in de beelden hieronder. In de fasecontrast foto is te zien dat Crenothrix lange, gelaagde filamenten vormt. Deze bacteriën worden gevonden in zuurstofarme wateren waar ze waarschijnlijk methaan oxideren en mangaan en ijzer in het milieu afzetten. Deze metalen zijn ook goed te herkennen in de foto als de roodbruine klonten. De tweede figuur laat hetzelfde beeld zien na kleuring met de stof acridine oranje. Deze kleurstof kan de cellen van Crenothrix zeer specifiek aantonen onder licht van een speciale golflengte. 
Twee microscopische beelden van Crenothrix sp. gewoon en na kleuring. Met dank aan: Bill Ghiorse.
Er zijn een heleboel soorten kleuringen beschikbaar met universele, maar ook hele specifieke, doelwitten. Een zeer bekende kleurreactie is bijvoorbeeld de Gram-test, die zeer veel gebruikt wordt om de celwand te determineren. Het protocol van de Gramtest kun je bekijken door hier te klikken. Een andere mogelijkheid is gebruik te maken van de DAPI kleuring, hierbij worden specifiek alle celkernen blauwzwart gemaakt. 
 

Fluorescentie

In de natuur komen veel organismen voor die uit zichzelf fluorescerende eigenschappen hebben. Een voorbeeld van dit fenomeen is de kwal Aequora victoria. Men is erachter gekomen dat één eiwit verantwoordelijk is voor deze fluorescentie, het GFP eiwit ('green fluorescent protein'). Het gen dat codeert voor dit eiwit is gekloneerd (specifiek geknipt uit al het genetische materiaal van de kwal) en in een vector (plasmide: een circulair stuk DNA dat fungeert als drager van genen) gezet. Aan deze vector is ook nog een bacteriële promotor toegevoegd, zodat het eiwit op het plasmide in de nieuwe gastheer in overmaat geproduceerd zal worden. De promotor is namelijk constitutief, wat eigenlijk wil zeggen dat het gen altijd “aan” staat. De bacterie heeft verder weinig last van deze genetische ingreep, hij groeit gewoon door. Dit zorgt ervoor dat bijvoorbeeld het kolonisatieproces van deze bacterie heel goed gevolgd kan worden onder microscoop zonder verdere omslachtige kleuringmethoden. 
De foto links laat een sojaboon zien, 36 uur na kolonisatie met Agrobacterium tumefaciens. Deze foto is afkomstig uit het archief van ASM, met dank aan Kim Finer. De foto rechts toont het resultaat van het genetisch modificeren van de bacterie E. coli met de luciferase genen van Vibrio fischeri. 
Er zijn ook andere manieren om bacteriën specifiek aan te tonen met fluorescentie zonder genetische manipulatie. De methode die hiervoor gebruikt kan worden heet FISH ('fluorescent in situ hybridization'). Voor deze techniek is grondige genetische kennis van het doelwit organisme wel noodzakelijk. Eigenlijk valt de methode in de categorie moleculaire technieken, omdat er gewerkt wordt op DNA niveau en vooral met ribosomaal DNA. Als de sequentie van het rDNA bekend is van een bacterie, kunnen probes ontworpen worden, dit zijn zorgvuldig samengestelde stukken enkelstrengs DNA die complementair zijn aan sequenties in de bacterie zelf (vergelijkbaar met een primer bij PCR, maar langer). Een goede probe hybridiseert alleen met het DNA van het doelwit organisme en niet met andere bacteriën in een culture. Aan de probe kan een fluorescent eiwit gebonden worden, zodat op het moment dat hybridisatie plaatsvindt, fluorescent licht wordt uitgezonden. Het ontwerpen en voornamelijk het valideren van probes neemt ontzettend veel tijd in beslag en daarom zijn er op de markt nog niet zoveel verkrijgbaar. Wel kun je soortspecifieke probes bestellen, om bijvoorbeeld alle melkzuurbacteriën in een culture aan te tonen.   

Isolatiemethoden
Doel van isolatie

Om te kunnen achterhalen wat de effecten kunnen zijn van micro-organismen op het milieu, is het van belang hun karakteristieke eigenschappen te bestuderen. Met deze eigenschappen worden vooral de metabole omzettingsreacties bedoeld, die uitgevoerd worden door het beestje. [De term metabolisme duidt op een  biochemische balans van alles wat er in het organisme gaat en wat er weer uitkomt.] Deze eigenschappen zijn het beste te bestuderen in een reincultuur, dat is een kweek waar maar één soort micro-organisme in voorkomt. 

Er zijn een aantal manieren om een reincultuur te verkrijgen. De meest eenvoudige methode is wel het extreem verdunnen van een vloeibare kweek. Een andere, conventionele, techniek is het maken van microbiële ophopingen. In een ophoping worden bepaalde condities vastgesteld, zoals temperatuur, substraat e.d. Hierdoor vindt er een soort selectie plaats: de micro-organismen die goed groeien bij de gestelde condities zullen dominanter worden in de gehele culture. Als de condities maar lang genoeg gehandhaafd worden, kan er een reincultuur verkregen worden.  Maar deze methoden werken lang niet voor alle micro-organismen. De schattingen lopen uiteen, maar men denkt dat tot nu toe slechts 0,1 tot 5 % van de gehele microbiële populatie in een reincultuur verkregen is. 

 

Micromanipulatie

Micromanipulatie is een speciale isolatie methode. Het bijzondere eraan is dat micro-organismen fysisch geïsoleerd worden van hun omgeving onder directe, visuele controle. Er wordt daarbij gebruik gemaakt van microscopie om de micro-organismen zichtbaar te maken, maar er zijn ook nog een aantal andere apparaten nodig. De belangrijkste zijn wel de micromanipulator (een robotarm die zeer precies bestuurd kan worden) en een pompsysteem (om hele kleine hoeveelheden vloeistof op te zuigen en weer uit te spugen). Verder zijn er capillairen (dunne, glazen buisjes) nodig, met een diameter die overeenkomt met het micro-organisme dat je wilt isoleren.

De procedure is eigenlijk heel simpel, maar het duurt even voordat je de techniek onder de knie hebt. Het is het makkelijkste om het gehele proces in een anaërobe kamer uit te voeren, ook als je niet met strikt anaërobe organismen werkt. Hiervoor zijn twee redenen aan te geven; ten eerste kun je het risico van infectie op deze manier enigszins beperken en ten tweede heb je een zeer hoge luchtvochtigheid nodig (om de verdamping van het druppeltje medium op het preparaatglas onder de microscoop te minimaliseren). Terwijl je kijkt naar het microscoopbeeld op de monitor, plaats je de capillair met de micromanipulator precies bij de door jou uitgekozen cel. Met de pomp zuig je een heel klein beetje vloeistof op (op de monitor zie je de bacterie dan verdwijnen) en dat  volume spuug je weer uit in vers medium.

Foto van de opstelling bij een micromanipulatie-experiment. Bovenin is het oculair van de inversmicroscoop is te zien. Rechts zie je de capillair, geplaatst in de houder van de micromanipulator, gericht op het preparaatglas.

Op de foto links zie je een afbeelding van de monitor waarop de capillair te zien is die in de culture vloeistof zit. Rechts zie je een afbeelding van de gehele proefopstelling. De anaërobe kamer is toegankelijk via de speciale “mouwen ”.  

 

Percoll gradiënt
Bij de toepassing van een percoll gradiënt wordt gebruik gemaakt van het feit dat er tussen  bacteriën verschillen bestaan in het soortelijk gewicht (of dichtheid) van de cellen. Want, ook al hebben de cellen vaak minuscule afmetingen en is er sprake van hele kleine verschillen, biedt deze eigenschap toch de mogelijkheid om een scheiding aan te brengen in een verzameling van micro-organismen. Voorwaarde is wel, dat je met een hele gevoelige gradiënt werkt.  
Een voorbeeld van een dergelijk materiaal is verkrijgbaar onder de commerciële naam Percoll. Deze viskeuze vloeistof bestaat uit deeltjes van variërende dichtheden. Daarbij zitten er ook gekleurde 'marker'-deeltjes in die ervoor zorgen dat een aantal numerieke dichtheden goed te zien zijn. Het hele concept is gebaseerd op het principe van centrifugering: na het centrifugeren hebben alle deeltjes met een bepaalde dichtheid zich op een bepaalde afstand van de bodem van de buis verzameld. De markerdeeltjes zijn hierbij te zien als gekleurde bandjes (zie ook de foto hiernaast). In een experiment worden twee buizen gevuld met de Percoll oplossing. Aan de ene, worden de markers toegevoegd aan de andere, de te scheiden culture. Na de centrifuge zie je, als het goed is, scherpe banden van de markers en van van de micro-organismen. In de foto zie je dat zich in het rechter buisje een bandje heeft gevormd van bacteriën met dezelfde dichtheid (en dus waarschijnlijk van dezelfde soort!) ongeveer ter hoogte van het lila bandje. Met een pipet kunnen de bacteriën laag voor laag opgezogen worden en separaat op platen of in flesjes gekweekt worden.
Foto van twee buizen na dichtheidscentrifugatie in percoll gradiënt. 
Op deze manier is het mogelijk om bijvoorbeeld methanogene en propionaatoxiderende bacteriën van elkaar te scheiden in een syntrofe gemeenschap (klik hier voor een link naar syntrofie in korrelslib). Als je een culture hebt met bacteriën die heel erg op elkaar lijken is de kans natuurlijk groot dat ook hun dichtheden heel erg weinig verschillen. Dan heeft het toepassen van het dichtheidsexperiment weinig effect.

Moleculaire technieken
Milieumicrobiologie heeft veel raakvlakken  met moleculaire ecologie. Hoewel moleculaire ecologie zich voornamelijk richt op het micro-organisme en zijn direct omgeving en in de milieumicrobiologie een wat bredere term voor milieu wordt gehandhaafd. De hieronder beschreven technieken worden veel gebruikt bij het karakteriseren van onbekende microbiële gemeenschappen.  
 

Ribosomaal DNA en RNA
Het erfelijk materiaal van elke cel bestaat uit DNA moleculen, een dubbelstrengse helix met de typische A (adenosine), C (cytosine), T (thymine) en G (guanine) nucleotiden, zoals ook te zien is in de afbeelding hiernaast. Voor meer info over de functie en de structuur van DNA, bezoek de volgende links (1,2,3). De reden waarom dit DNA zo een grote invloed kan uitoefenen, is het feit dat in de nucleotidevolgorde een code geschreven staat die uiteindelijk kan leiden tot de productie van een willekeurig eiwit. De meeste eiwitten zijn in de cel essentieel voor het verloop van biochemisch processen, functionerend als katalysator. Om tot een eiwit te komen moeten eerst een aantal stappen doorlopen worden. Allereerst wordt een DNA streng gesplitst in enkele ketens en van één van deze wordt een kopie gemaakt (transcriptie). Deze copie heet RNA, is enkelstrengs en bevat in plaats van thymine, uracil als base.
Schematische voorstelling van DNA
De RNA moleculen kunnen de celkern verlaten en trekken de cel in. Daar vinden ze een ribosoom (een eiwitcomplex waar zo direct meer informatie over volgt) waar de eiwitproductie gestart kan worden. De basen worden in setjes van drie (codons) afgelezen door het ribosoom (translatie) en deze zoekt daar de bijbehorende tRNA  bij uit het cytoplasma van de cel. Een tRNA bevat de complementaire sequentie van het codon, met daarin vastgemaakt een aminozuur. Elke keer dat er een codon wordt afgelezen, wordt er een aminozuur toegevoegd aan de groeiende keten en zo vormt zich uiteindelijk een eiwit.
Omdat eiwitproductie een universeel proces is waar nagenoeg alle organismen gebruik van maken, komen ribosomen ook in elk organisme voor. Dat maakt het ribosomale DNA (het DNA dat voor ribosomen codeert) heel interessant als marker molecuul. Omdat het zo een wijdverspreid fenomeen is, kun je het heel goed gebruiken om verschillen tussen soorten te beoordelen en meer te weten te komen over de evolutionaire achtergrond. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de sequenties van het 16S rDNA (zie ook het schema hiernaast). Het rDNA speelt vooral een belangrijke rol in de moleculaire ecologie. Met behulp van moleculaire technieken kunnen afzonderlijke micro-organismen in een ecosysteem gedetecteerd worden, zonder dat het nodig is deze soort in reincultuur te hebben. Door sequenties te vergelijken met gegevens uit een database kun je te weten komen of er bijvoorbeeld een Desulfovibrio in het waterzuiveringsslib zit, of er nieuwe soorten zijn bijgekomen sinds de vorige keer dat er tests gedaan werden, of de dominante soort het meeste lijkt op een Clostridium of op een Bacillus, en ga zo maar door.   
Het ribosoom bestaat uit twee delen waartussen de RNA streng als het ware geklemd wordt. S slaat op de centrifugeer snelheid van het deeltje. 
DNA isoleren uit een ecosysteem is niet zo heel erg moeilijk. Maar hoe krijg je uit al dat erfelijk materiaal alleen het 16S rDNA te pakken? De oplossing daarvoor ligt in de polymerase chain reaction (PCR) (klik hier voor het principe achter deze techniek). Het bijzondere van 16S rDNA is namelijk dat er veel verschillen zijn tussen micro-organismen onderling, maar dat het ook juist zeer gelijk is op bepaalde stukken (dit worden ook wel geconserveerde regio's genoemd). Van die constante gebieden wordt gebruik gemaakt bij het ontwerpen van een primer voor PCR. Deze primer vindt het complementaire gedeelte in het enkelstrengse DNA, gaat eraan vast zitten en zorgt er voor dat precies het 16S rDNA gedeelte duizenden malen geamplificeerd wordt. Op die manier krijg je de marker vrij gemakkelijk in handen. 

 

DGGE - microbiële consortia in één oogopslag
DGGE staat voor 'denaturing gradient gel electrophoresis. Gewone gelelektroforese is een methode die vaak gebruikt wordt om fragmenten DNA of RNA te scheiden naar grootte. Hierbij worden verschillende fragmenten omgeven met negatief geladen deeltjes (SDS). Een gel kan gegoten worden van een waterige oplossing met bijvoorbeeld agarose. Nadat de gel gestold is, is er een netwerk gevormd of matrix. Over deze gel wordt een spanningsverschil aangesloten, zodat al negatief geladen DNA fragmenten de gel in worden getrokken. Hoe kleiner het fragment, des te gemakkelijker kan hij zich manoeuvreren door de matrix en des te verder zal hij eindigen in de gel. Alle fragmenten kunnen na afloop zichtbaar gemaakt worden door bestraling met UV-licht. 
Een DGGE heeft nog een extra aspect naast het toepassen van een ladingsverschil. Er wordt namelijk een speciale gel gegoten waarin een gradiënt zit van een denaturerende stof (een middel dat dubbelstrengs DNA uit elkaar doet vallen naar enkelstrengs). Boven in die gel is de concentratie denaturant bijv. 35 v% en onderin 50 v%. De PCR reactie die voorafgaat aan de gelelektroforese amplificeert een zeker fragment van het rDNA met universele primers op de constante regio‘s. Maar één van de twee primers bevat een extra stuk DNA, de zogenoemde GC-klem ('clamp'). Dat is in feite gewoon een lange reeks G- en C-basen achter elkaar. Deze nucleotiden zijn, in dubbelstrengs DNA, met elkaar verbonden via 3 waterstofbruggen, terwijl AT paren maar twee H-bruggen delen. Dat maakt deze GC-staart heel stabiel in denaturant, en dat is precies de bedoeling.  
Foto van een DGGE gel. 

 

 
De PCR fragmenten worden gedurende 16 uur aan een hoog voltage en aan denaturant blootgesteld. De consequenties zijn afgebeeld in de figuur hiernaast. Het dubbelstrengs DNA smelt gedeeltelijk uit elkaar, al naar gelang van de nucleotidenvolgorde (!), en de GC-klem houdt de twee strengen bij elkaar. De vorkstructuur loopt uiteindelijk vast in de matrix van de gel, door de toenemende weerstand. Na kleuring zijn bandjes te zien  van de laatste positie van elk fragment. Omdat het rDNA als eigenschap heeft dat de sequentie zo verschillend is per organisme, zal elk organisme in een gemeenschap een bandje geven op een unieke hoogte!  
Schema van het DGGE proces, lees bijstaande tekst voor verduidelijking. 
 
Klonering in E. coli - generatie van een ribosomale DNA bank
Alhoewel DGGE een mooie en snelle manier is om te zien hoeveel verschillende soorten er in een monster zitten en met name verschillen in tijd of condities te bestuderen, geeft het weinig informatie over de individuele soorten. Het is natuurlijk een poging waard te proberen een aantal van deze specifieke soorten te isoleren en zo in reincultuur te karakteriseren, maar aangezien dit vaak met grote problemen gepaard gaat, is het ook aan te bevelen te werken met andere moleculaire technieken. Het principe van klonering is dat het totale ribosomale DNA van een gemengde culture vermenigvuldigt wordt met PCR. Deze fragmenten worden geligeerd in een vector. De vectoren worden tenslotte gemengd met competente cellen van E. coli (competent wil in dit geval zeggen dat de celwand gedeeltelijk beschadigd is, zodat het vreemde DNA de cel makkelijker binnen kan komen). Na afloop van het recombinatieproces bevat elke E. coli cel een stukje DNA van één van de vele soorten in de oorspronkelijke gemeenschap. Door de bacteriën te screenen met een aantal criteria, kan achterhaald worden welke bacterie wat bevat en bijvoorbeeld hoe de dominantie verhoudingen liggen binnen een bepaalde gemeenschap. Ook is het nu mogelijk de inserties te sequensen en d.m.v. een 'blast-search' in een database de soort- of familie naam te achterhalen. Een voorbeeld van een database met verschillende genoomsequenties beschikbaar, kun je bekijken door  hier te klikken. Een paar details omtrent de kloneringstrategie worden uitgelegd in dit schema. 

 

Moleculaire ecologie
Zoals ook al een beetje verteld werd in de inleiding, spelen deze  moleculaire technieken voornamelijk een rol in de moleculaire ecologie. Moleculaire ecologie is een soort onderdeel van milieumicrobiologie. Veel van de technieken, gebaseerd op DNA, RNA of eiwitten, die de laatste decennia zijn ontwikkeld hebben toepassingen gevonden in de milieumicrobiologie. Automatisering begint, zoals in zoveel werkgebieden, een steeds grotere rol te spelen. Het kloneren en sequensen van  honderden sequenties kan ontzettend veel tijd in beslag nemen en daarom zijn er robots en chips op de markt gebracht die het gehele proces zouden kunnen versnellen. Een chip is een heel klein plaatje (ongeveer 1 vierkante centimeter!) van glas waarop een geautomatiseerde arm wel duizend “spots” maakt. Spots zijn minuscule druppeltjes die bestaan uit strengen DNA of RNA. Meer informatie over hoe al deze technieken informatie gecombineerd kunnen worden vind je op deze projectomschrijving.