Toepassingen

Onder aërobe omstandigheden is gebleken dat de hoog gechloreerde verbindingen in de bodem zeer persistent zijn. Milieumicrobiologen hebben zich daarom met name gericht op het bestuderen van anaërobe, microbiële mechanismen om deze stoffen af te breken tot minder vervuilende componenten. Er bestaat een aanzienlijke kans dat uit bodemonsters, vervuild met deze verbindingen, micro-organismen geïsoleerd kunnen worden die in staat zijn de gechloreerde verbindingen af te breken. Die theorie is gebaseerd op de principes van evolutionele selectie: als een organisme maar lang genoeg blootgesteld wordt aan een bepaalde omgevingsfactor, treedt er vanzelf adaptatie op.

De geïsoleerde bacterie

Dit bleek een succesvolle aanpak te zijn (in de foto rechts zie je een voorbeeld van hoe het adaptatieproces bewerkstelligd kan worden). Ondertussen zijn er een aantal organismen geïsoleerd die in staat zijn de vervuilende stoffen gedeeltelijk of geheel af te breken. Daarbij is een tweedeling aan te geven. De eerste groep bevat organismen die gechloreerde koolwaterstoffen co-metabolisch afbreken, d.w.z. dat ze deze verbindingen alleen in combinatie met andere substraten kunnen degraderen. Meestal is het voornamelijk toeval dat tijdens dit proces de schadelijke stoffen ook afgebroken worden. Tot de tweede groep behoren micro-organismen die in staat zijn de afbraak direct te koppelen aan de generatie van energie voor groei en deze kunnen dus ook leven in een omgeving waarin bv. tetra het enige substraat is. Voor de toepassing van micro-organismen voor het opruimen van milieuverontreiniging is deze tweede groep natuurlijk het interessantst.

Anaëroob kweekflesje met bacteriën. Fase A bevat grondwater met de vervuilende stoffen en fase B bevat de vervuilde bodem.

Het mechanisme dat gebruikt wordt voor de afbraak van PER heet reductieve dechlorering (zie ook metabole mogelijkheden). In de reductiereactie wordt elk chlooratoom stapsgewijs vervangen door een waterstofatoom.

Twee bekende voorbeelden van bacteriën uit deze groep zijn wel Dehalobacter restrictus (geïsoleerd uit Rijn slib door onderzoekers van de universiteit in Wageningen) en Desulfitobacterium dehalogenans (gevonden in Amerika).Op de foto rechts zie je een afbeelding van Dehalobacter restrictus. In werkelijkheid is de bacterie ongeveer 3 µm lang. Hij is in het bezit van een flagel (dat is de dunne streep die je op de foto naar boven ziet wijzen). Door deze "staart" als een propeller rond te draaien komt de bacterie vooruit.

Elektronenmicroscopische opname van Dehalobacter restrictus.

Metabole mogelijkheden

Door gedeeltes van het DNA te vergelijken met het erfelijk materiaal van andere micro-organismen, kon worden geconcludeerd dat met Dehalobacter restrictus een unieke, nieuwe soort is ontdekt. Maar het belangrijkste aspect blijft natuurlijk zijn potentie tot het afbreken van gechloreerde koolwaterstoffen. En om de bacterie te kunnen gebruiken tegen de milieuverontreiniging is het nodig meer inzicht te verkrijgen in de mechanismen die hierbij een rol spelen. Inmiddels is een groot deel van de metabole route aan het licht gebracht. Het belangrijkste, niet co-metabolische, mechanisme voor de afbraak van PER is dat van de reductieve dechlorering, oftewel halorespiratie. Hierbij wordt een gechloreerd koolwaterstof molecuul gebruikt om mee “adem te halen” (respireren), zoals mensen bv. zuurstof gebruiken. In dit proces wordt PER dus gebruikt als (intermediaire) elektronenacceptor. Bestudeer onderstaande figuur voor meer details.

In de figuur links zie je een schematische weergave van een model voor (de)halorespiratie. Buiten de cel worden waterstofmoleculen omgezet in reductie-equivalenten [protonen + elektronen]. De elektronen die vrijkomen bij de waterstofreactie worden gebruikt om, via het celmembraan, reductieve dechlorering te laten plaatsvinden. Het chlooratoom wordt vervangen door een waterstofatoom en daarbij overgedragen naar een elektronenacceptor in de cel. De protonen worden vervolgens naar binnen getrokken (blauwe pijl) om energie, in de vorm van ATP, te produceren.

Bioschermen

In de praktijk kunnen bodemverontreinigingen door micro-organismen worden opgeruimd, o.a door het plaatsen of creëren van bioschermen. Een bioscherm heeft als belangrijke eigenschap dat het een in situ methode is, d.w.z dat er ter plekke van de verontreiniging in de bodem afbraak plaats zal vinden. Een bioscherm vormt een zone, vaak loodrecht op de grondwaterstroming, die gepasseerd moet worden door het grondwater met de vervuilende verbindingen. In het bioscherm gaan micro-organismen groeien, omdat dit gestimuleerd wordt door de toevoeging van voedsel (zoals suiker en waterstof) en groeibevorderaars (zoals stikstof en fosfor). Na passage van het bioscherm zijn de schadelijke verbindingen in het grondwater (gedeeltelijk) afgebroken. In de tekening hieronder is een overzicht te zien van het effect van de bouw en plaatsing van een bioscherm op de vervuilende verbinding PER.

De PER verontreiniging in de bodem verspreidt zich vrij gemakkelijk over een grote oppervlakte door de aanwezigheid en stroming van het grondwater. De van nature aanwezige micro-organismen kunnen de vervuiling maar gedeeltelijk af breken. Dit kan een risico vormen voor mensen in de omgeving, want er wordt cis-dichlooretheen (cis-DCE) gevormd en uiteindelijk het zeer schadelijke, en bovendien vluchtige, vinylchloride (VC). Het plaatsen van bioschermen gecombineerd met het stimuleren van de groei van de juiste micro-organismen, zorgt ervoor dat de vervuilende stoffen omgezet worden in het onschadelijke etheen.

Het plaatsen van bioschermen heeft zowel voor- als nadelen. Grote pluspunten zijn de lage kosten die eraan verbonden zijn en het feit dat het als een weinig destructieve methode kan worden beschouwd. Dit geldt vooral als je het vergelijkt met het meest gangbare alternatief: het afgraven van de grond en het apart behandelen. Nadelen zijn dat je moet uitzoeken of de juiste micro-organismen er voorkomen en er kunnen groeien, oftewel een ecologische karakterisatie van de locatie is vereist. Tevens kan het een vrij langzame methode zijn, aangezien je afhankelijk bent van de groeisnelheid van de micro-organismen. Vooral anaërobe bacteriën groeien langzaam.

Voorbeelden uit de praktijk

Bioschermen lopen in de praktijk nogal uiteen voor wat betreft aard en vorm. Het kan bestaan uit de oorspronkelijke bodem maar het kan ook een sleuf zijn waarin dragermateriaal (ijzervijlsel, zand/grind, compost) wordt gestort, waaraan de micro-organismen zich kunnen hechten en groeien. Een ander systeem is gebaseerd op het plaatsen van filters en complexe pompinstallaties. Een aantal voorbeelden van schermconstructies en de uitleg van de werking ervan is te vinden op de "digitale ontmoetingsplaats voor bodemdeskundigen, overheden, grondeigenaren en saneerders
én voor slachtoffers van bodemvervuiling". Een soortgelijke site maar dan in het Engels is die van PBR.

Een succesvol voorbeeld van een groot bioscherm in Nederland is te vinden in Uden in Noord-Brabant, waar de bodem verontreinigd is met de al eerder genoemde verbinding PER (tetrachlooretheen) ten gevolge van lozingen door twee voormalige chemische wasserijen. Een tweede voorbeeld is het bioscherm dat op het terrein AKZO Nobel in Hengelo aangelegd is. De verontreiniging daar is een erfenis van een bedrijf dat voor 1950 bestrijdingsmiddelen produceerde.
Het Laboratorium voor Microbiologie van de Wageningen Universiteit neemt deel aan een grootschalig EU-project: het zogenaamde multi-barrier project. Het doel van het multi-barrier project is het ontwerpen van een systeem waarin meerdere schermen achter elkaar worden geplaatst om zo een verwijdering dan wel afbraak te bewerkstelligen van een scala aan schadelijke stoffen. Met meerdere schermen wordt bedoeld dat er niet alleen afbraak door micro-organismen optreedt, maar dat er ook schermen zijn die via chemische afbraak, neerslagvorming of door sorptie van de verontreiniging voor een schoonmaken van het grondwater zorgen. Zo'n systeem is vooral nodig als er zowel organische verbindingen als zware metalen in het grondwater voorkomen. Zie voor meer informatie over het project: http://www.multibarrier.vito.be/

Waterzuivering - korrelslib

Waarschijnlijk sta je er niet bij stil, maar het meeste water dat uit de kraan komt wordt eerst grondig gezuiverd met behulp van diverse soorten bacteriën. De micro-organismen in een waterzuiveringsinstallatie leven van de vervuilende componenten in het water en breken ze af. Als gevolg daarvan groeit de biomassa en wordt het water schoon.

Anaëroob vs. aëroob

Met name op het gebied van de anaërobe zuivering wordt de laatste decennia veel onderzoek gedaan. Daar zijn verschillende redenen voor. Ten eerste kost de beluchting in een aërobe installatie ontzettend veel energie en is dus duur. Daarbij worden bepaalde stoffen efficiënter omgezet in een anaërobe omgeving en groeit het zuiveringsslib minder hard (slib is een term die gebruikt wordt voor de verzameling van verschillende micro-organismen in een waterzuiveringsinstallatie). Een laatste voordeel is dat erbij anaërobe zuivering doorgaans energie geproduceerd wordt, in de vorm van methaan (CH₄). Als je meer wilt weten over het ontwerpen van anaërobe waterzuiveringsinstallaties, kijk dan eens naar de website van Paques.

UASB reactor

De UASB reactor is één van de meest toegepaste anaërobe reactorontwerpen in de wereld. UASB staat voor Upflow Anaerobic Sludge Bed. Rechts zie je een schema van hoe zo’n reactor in werkelijkheid werkt. De term “Upflow” geeft aan dat de het water van onder naar boven gepompt wordt: het vieze water (influent) wordt over een aantal openingen in de bodem van de reactor verdeeld. Het water passeert vervolgens een zogenaamd sludgebed; de micro-organismen in het slib krijgen nu de kans om alle stoffen, die ze kunnen gebruiken om te groeien en om energie te genereren, uit het water te halen. Als afvalproduct produceren sommige micro-organismen (de zgn. Archaea) hierbij methaan. Het methaangas stijgt naar boven (witte belletjes).

Schematische voorstelling van de werking van een UASB reactor.

De opwaartse stroming (van het water en het geproduceerde gas) neemt de slibdeeltjes mee. Maar het slib heeft een aantal zeer bijzondere karakteristieken (zie ook syntrofie in korrelslib), waardoor het onder invloed van de zwaartekracht weer terugzakt naar de bodem van de reactor om het gehele proces weer opnieuw te kunnen doorlopen. Dat is maar goed ook want anders zou het slib door uitspoeling verloren gaan. Boven het wateroppervlak hangt een installatie die de "dome" gascollector wordt genoemd. In feite worden hier drie fasen van elkaar gescheiden: het biogas (1) stijgt tot in de top van de reactor en wordt verzameld in kegelvormige ruimtes, het effluent, het “schone” water (2) wordt net onder het oppervlak afgepompt en het slib (3) bezinkt. Sinds oktober 2002 bestaat er een website waar getracht wordt om de technologie van anaëroob korrelslib plus wetenswaardigheden voor een groter publiek duidelijk te maken.

Syntrofie in korrelslib

Het slib in een UASB reactor heeft als bijzondere eigenschap dat het spontaan korrels vormt, die goed bezinken. Dit komt deels door de stromingsdynamiek in de reactor maar ook doordat de verschillende soorten micro-organismen elkaar nodig hebben! In de biologie wordt de term syntrofie gebruikt voor dergelijke interacties. Het geeft aan dat bepaalde organismen wederzijds afhankelijk van elkaar zijn. In het slib spelen zulke interacties een belangrijke rol. Het heeft voornamelijk te maken met de variëteit van substraten dat wordt aangeboden in het afvalwater en de beperkte mogelijkheden van een micro-organisme. Klik hier voor het openen van een overzicht van alle metabole omzettingen die bijvoorbeeld plaatsvinden in de anaërobe waterzuivering van een papierfabriek.

Rechts zie je een slibkorrel, of "granule". In zo’n korrel zijn drie lagen te onderscheiden. De buitenste laag (1) bevat bacteriën die polymeren kunnen afbreken, de eerste stap van het netwerk van afbraakreacties. Deze kleinere brokstukken kunnen worden verwerkt door de tweede laag micro-organismen (2), hier vinden de syntrofe interacties vooral plaats. De kern van de korrel (3) bestaat voornamelijk uit anorganisch en dood bacterieel materiaal.

Als gevolg van de afbraak van polymeren ontstaan kleinere brokstukken, met name glucoseeenheden in het voorbeeld. Wanneer deze moleculen vervolgens ook weer onderworpen worden aan microbiële activiteit worden er verschillende organische vetzuren gevormd. De belangrijkste daarvan zijn propionaat (3 C ‘s) en butyraat(4 C ‘s). De afbraak van deze stoffen gebeurt doorgaans niet zo gemakkelijk. Normaal gezien (in afwezigheid van een fermentatief metabolisme of een anorganische elektronenacceptor) zouden er bij de oxidatie van propionaat of butyraat namelijk reductie-equivalenten ([H]) worden gevormd. Deze kunnen niet hergebruikt worden en werken uiteindelijk remmend op de oorspronkelijke afbraakreactie. (Dit heeft te maken met de thermodynamica van de verschillende reacties en de aard van de elektroncarriers, NAD⁺of ferrodoxine; voor meer info, klik hier.) Syntrofe micro-organismen hebben hier een oplossing voor gevonden. Door in de directe nabijheid te leven van andere micro-organismen die [H] ‘s consumeren, wordt de waterstofpotentiaal voldoende laag gehouden om een leefbaar milieu te creëren. Archaea (methanogene bacteriën) kunnen m.b.v. de reductie-equivalenten bijvoorbeeld methaan produceren.

In de figuur rechts zie je een schematische voorstelling van de syntrofe relaties betrokken bij de afbraak van korte organische vetzuren. Zoals hierboven beschreven komen er bij de afbraak van propionaat en butyraat [H] ‘s vrij (blauw vlak). Mits de syntrofe bacterie zich in de nabijheid van bv. een Archaea (rechter helft figuur) bevindt, kunnen de reductie- equivalenten doorgegeven worden aan deze methanogene bacteriën, die de [H] ‘s vervolgens gebruiken om methaan te produceren. Beide micro-organismen hebben voordeel van deze manier van interactie.

Isolatie en karakterisatie van micro-organismen uit slib

Ondanks het feit dat de mens al eeuwen gebruik maakt van de zuiverende capaciteit van micro-organismen, is er nog maar heel weinig bekend over de individuele bacteriën die elk een klein stukje van een grote afbraakroute voor zich nemen. Voornaamste reden hiervoor is waarschijnlijk dat de bestaande processen goed functioneerden en er dus niet gerommeld hoefde te worden aan de karakteristieken van de biomassa. Als er een nieuwe zuiveringsinstallatie opgestart moet worden, wordt er gewoon een bepaalde hoeveelheid slib uit een oude reactor gehaald wordt als entmateriaal. Voordeel daarvan is dat, na bepaalde adaptatie tijden, zeer stabiele gemeenschappen van micro-organismen worden gecreëerd. Maar recente ontwikkelingen wijzen uit dat de eisen aan waterzuiveringsinstallaties steeds strenger worden wat betreft de lozingen. Behalve het reinigen van huishoudelijke afvalwater (grote hoeveelheden, lichte vervuiling) worden nu ook industriële waterstromen (kleinere volumes, specifiekere en hogere contaminaties) op grote schaal gereinigd met anaërobe installaties.
Inmiddels is een aantal groepen micro-organismen in het waterzuiveringsslib goed onderzocht. Dit betreft met name die bacteriën die verantwoordelijk zijn voor de eerste stappen in het afbraakproces, in grote getale vertegenwoordigd zijn of gemakkelijk te isoleren zijn. Onder de “moeilijke” bacteriën worden de al eerder besproken syntrofe bacteriën verstaan. Juist omdat ze afhankelijk zijn van een ander organisme (obligaat of facultatief), is het soms onmogelijk een culture volledig rein te krijgen (zie ook isolatiemethoden onder technieken). Toch kan het bestuderen van ophopingen interessante vragen oproepen en ook leuke plaatjes opleveren. Hiernaast zie je bijvoorbeeld een microscopische foto van een kweek van anaërobe bacteriën met propionaat als substraat. De groengele kleur duidt op de aanwezigheid van methanogene bacteriën. Uit deze foto blijkt heel duidelijk dat de verschillende micro-organismen zich het liefst zo dicht mogelijk rondom de methanogene bacteriën bevinden, zodat ze gemakkelijk de reductie-equivalenten kunnen afgeven.	Foto van een cluster van propionaatoxiderende bacteriën onder fluorescent licht. De meeste methanogene bacteriën bevatten een stofje dat factor F-420 heet. Bij bestraling met licht met een golflengte van 420 nm, zendt deze factor fotonen uit, waardoor een groengele gloed ontstaat. Zelfs op zo‘n kleine schaal (dit is een monster uit een flesje van 50 ml) is de typische korrelvorming al te observeren!

Met enige moeite is het Frank de Bok (Wageningen Universiteit) gelukt om een syntrofe bacterie in reincultuur te verkrijgen. Om de bacteriën van elkaar te scheiden heeft hij een aantal onconventionele methoden toegepast, zoals de Percoll gradiënt (deze staat beschreven onder isolatiemethoden.

In het plaatje rechts zie je een microscopische foto van een co-cultuur (cultuur met slechts twee soorten) van de propionaat afbrekende bacterie Syntrophobacter fumaroxidans (MPOB; klein en ovaalvormig) en de methanogene bacterie Methanospirillum hungatei (gekromde staaf). Uit MPOB zijn verschillende enzymen geïsoleerd die een rol zouden kunnen spelen bij het fenomeen syntrofie. Er zijn minstens drie soorten hydrogenases aangetroffen (transport van reductie-equivalenten ([H]‘s) over het celmembraan), maar ook twee verschillende formaatdehydrogenases (transport van formaat)! Dit doet vermoeden dat niet alleen [H]‘s uitgewisseld worden tussen verschillende soorten, maar dat formaat hierin ook een belangrijke schakel vormt.

Foto gemaakt met fasecontrast microscoop van co-cultuur van MPOB met Methanospirillum hungatei.

Recent onderzoek

Vreemd genoeg is er eigenlijk heel weinig bekend over de verschillende micro-organismen die voorkomen in het slib en over wat hun specifieke rol is binnen het hele ecosysteem. Toch is deze informatie belangrijk bij het veranderen en optimaliseren van een waterzuiveringsproces. Bij het Laboratorium voor Microbiologie (Wageningen UR) wordt hiernaar onderzoek gedaan en wel in twee richtingen (zie ook deze projectomschrijving: integratie tussen moleculaire ecologie en microbiële fysiologie) ; enerzijds is het doel dominante bacteriën uit het slib te isoleren en te karakteriseren, anderzijds probeert men een moleculaire detectiemethode (zie ook moleculaire technieken) te ontwikkelen waarmee snel zichtbaar gemaakt kan worden welke micro-organismen aanwezig zijn.

Het isoleren van een bacterie, met bijzondere eigenschappen, uit waterzuiveringsslib kan een grote ontdekking betekenen. De eerdergenoemde stikstofafbrekende bacterie Brocadia anammoxidans is hiervan een sprekend voorbeeld. Naar aanleiding van het microbiële onderzoek is er een volledig nieuw reactorontwerp op tafel gekomen. Er wordt gezegd dat het nieuwe proces tien keer zo goedkoop is, geen chemicaliën vereist, bijna tien keer zo weinig energie kost en dus tien keer minder CO₂ uitstoot. Voor meer informatie over dit onderwerp klik hier.

Bescherming tegen infectie met anthrax sporen betekent een volledig afgesloten pak met geen enkele mogelijkheid tot uitwisseling van lucht met de externe omgeving. Een gasmasker is dus lang niet voldoende en daarbij moet hij aan zeer hoge eisen voldoen qua materialen en naadbewerking. Bijna alle, tot nu toe onderzochte, stammen van Bacillus anthracis zijn gevoelig voor penicilline. Het antibioticum vervult zijn werking door specifiek de celwand te vernietigen van lichaamsvreemde cellen. Mits de infectie op tijd gesignaleerd wordt, kan de start van een antibiotica kuur levens redden. Andere bronnen (BBC- website) schilderen een wat somberder scenario: indien anthrax sporen zich hebben gevestigd in de longen en reeds een infectie zijn begonnen, sterft negen op de tien mensen. Eén van deze negen kan gered worden door antibiotica.

De sporen zijn geurloos, kleurloos en smaakloos. Ze kunnen worden vernietigd door verbranding, hittebehandeling (autoclaaf 121°C, 30 minuten), of blootstelling aan formaldehyde 4% gedurende meer dan 12 uur. Besmette oppervlakken kunnen worden gedesinfecteerd met een 0.5% hypochlorietoplossing (bleekmiddel).